Kaedah penghadaman kolagenase - kultur sel stem mesenchymal tali pusat

Sel stem mesenchymal tali pusat manusia mempunyai potensi pembezaan yang tinggi, gen yang stabil, tidak terdedah kepada mutasi, dan tidak menyebabkan tumor; mereka tidak memerlukan padanan dan tiada penolakan, dan digunakan secara meluas dalam rawatan penyakit dan penyelidikan anti-penuaan. Pada masa ini, aplikasi dalam industri kecantikan dan untuk kumpulan sub-kesihatan juga semakin menarik perhatian.

Tali pusat sel stem mesenchymal tali pusat terdiri daripada kapsul, gusi Huatong, vena pusat dan pusat arteri umbilicus. Sel stem mesenchymal tali pusat terdapat dalam gusi Huatong.
Oleh kerana jumlah yang kecil, jumlah sel yang diperoleh selepas pencernaan dengan kolagenase adalah kecil. Di samping itu, apabila kolagen diperolehi dengan kaedah penghadaman kolagenase am, kolagenase lebih berbahaya kepada sel, dan sel yang dikultur berada dalam keadaan yang lemah.

Kaedah tampalan ialah kaedah yang biasa digunakan untuk mengkultur sel mesenchymal tali pusat manusia, tetapi sel-sel keluar dari tisu untuk masa yang lama (10-20 hari atau lebih lama lagi). Selepas penerokaan berterusan, kami menemui cara untuk mendapatkan sel stem mesenchymal tali pusat melalui pencernaan kolagenase.

Kaedah operasi khusus adalah seperti berikut:
1 Selepas memotong tali pusat bayi dan tali pusat ibu, segera kepit dengan pengapit tali pusat untuk mengelakkan pencemaran dalaman. Masukkan ke dalam beg steril (bekas) dan pindahkan ke makmal.
2 Dalam kabinet biokeselamatan atau di bangku bersih, tanggalkan tali pusat dan gunakan rendam alkohol 75% selama 2 minit (tiub empar 50ml atau hidangan 250px). Jika tali pusat panjang dan tidak boleh dimuatkan ke dalam bekas, tali pusat boleh dipotong kepada kira-kira 250px, tetapi pengapit tali pusat mesti ditambah sebelum memotong untuk mengelakkan alkohol daripada memasuki tali pusat dan merosakkan sel.
3 Selepas rawatan dengan alkohol, cepat-cepat pindahkan ke dalam bekas berisi PBS atau garam selama 2 kali, 2 minit setiap kali.
4 Potong klip tali pusat, potong tali pusat kepada segmen 2-75px, gunakan gunting untuk memotong tali pusat dari bahagian dalam vena pusat, dan gunakan kala jengking (tisu tali pusat agak licin, dengan kala jengking vena pusat) untuk operasi tali pusat. kord. Sampul surat dikeluarkan untuk menghalang penggabungan pelbagai sel.
5 Potong tisu tali pusat dengan gunting, cairkan 0.1% jenis II kolagenase (larutan pencairan dengan DMEM/F12) semalaman, dan hadam semalaman pada suhu 4 °C.
6 Keesokan harinya, tuangkan tisu yang tidak dihadam ke atas skrin keluli 100 mesh (80 mesh, 160 mesh) (sebaik-baiknya skrin mesh keluli, membawa sejumlah besar tisu untuk operasi mudah), dengan PBS (atau saline) bilas beberapa kali untuk mengeluarkan sebanyak mungkin kolagenase dari permukaan tisu. Akhir sekali, bilas dengan 1-2 kali medium lengkap untuk mengeluarkan PBS (atau garam).
7 Tuangkan ke dalam pinggan (menyusahkan untuk dimasukkan ke dalam botol), tambah sedikit kultur sederhana pada blok tisu yang tidak dicerna (6ml tambah 2-3ml, 10ml tambah 3-4ml) (tujuannya adalah untuk mengurangkan baki kolagenase pada sel) sakit). Keesokan harinya, blok tisu hilang sepenuhnya (kolagenase yang direndam dalam tisu telah dicerna), sel-sel telah tersebar sepenuhnya, dan di bawah mikroskop, terdapat banyak sel tersebar dalam tisu yang sudah dicerna. Sebilangan kecil medium (150 px campur 2-3 ml, 250 px tambah 4-5 ml) telah ditambah pada medium dan kultur diteruskan.
8 Selepas dua hari, teruskan menambah sedikit medium (150px tambah 2-3ml, 250px tambah 4-5ml).
9 Selepas satu atau dua hari, bilangan sel akan meningkat dengan ketara (banyak pertumbuhan koloni), dipindahkan ke dalam dua tiub emparan 50ml, tambah PBS (atau garam) kepada 50ml, campurkan, emparan pada 2500rpm, 6min.
10 Resuspensi dalam 5-6 ml (bergantung kepada jumlah sel) dalam medium lengkap, sentrifuge pada 1000 rpm selama 6 minit, masukkan ke dalam kelalang T25, dan tambah 5 ml medium lengkap.
Selepas 13 hari, kultur boleh diteruskan dengan menukar medium atau menambah 3-4 ml medium lengkap. Selepas setiap tiga hari, tukar cecair sehingga habis (lebih daripada 70% boleh diturunkan)

Catatan wahyu:
1 Kaedah ini mudah dikendalikan dan mempunyai masa pengeraman yang singkat.
2 Pencernaan tali pusat dengan kolagenase, pada 37 ° C, tali pusat pada dasarnya boleh dihadam dalam beberapa jam, tetapi pada masa yang sama kerosakan pada sel lebih besar. Kolagenase boleh menembusi ke dalam tisu tali pusat, dan kepekatan rendah kolagenase mencerna tisu dari dalam ke luar, menyebabkan kurang kerosakan pada sel. (Trypsin mempunyai kesan penghadaman yang sangat lemah pada tisu tali pusat)
3 Sebab untuk mencerna tisu sepenuhnya dan tidak mengasingkan sel secara berasingan ialah komponen kolagen umbilical (likat) menggalakkan pembiakan sel stem mesenchymal cord. Kebanyakan sel terampai dalam kolagen dan membiak dalam koloni, yang merupakan sebab utama mengapa sel disimpan dalam keadaan baik.
4 Semasa mengkultur sel stem mesenchymal tali pusat, jangan gunakan medium yang mengandungi serum (serum menggalakkan pembezaan sel), tetapi gunakan medium khusus sel stem. Laluan juga cuba untuk tidak penghadaman trypsin (kerosakan trypsin pada sel stem mesenchymal tali pusat), jus pencernaan khas harus digunakan untuk memastikan lebih banyak masa laluan.