Pengasingan PriCells-Sel Dendritik Limpa Tikus-Pencernaan Kolagenase untuk Menyediakan Suspensi Sel Limpa
Program bantu:
Penyediaan penggantungan sel limpa oleh pencernaan kolagenase
Bahan Eksperimen:
1. 4000U/ml kolagenase D, cair dan diletakkan di atas ais
2. HBSS, disterilkan, mengandungi Ca + , Mg 2+ (dibeli dalam Life Technologies)
3. Limpa tikus
4. Jarum hipodermik, 22G × 1 1/2 diameter (Becton Dickinson)
5. 10ml, 5ml picagari pakai buang (seperti Becton Dickinson)
6. Piring petri berdiameter 100mm (cth Falcon)
7. Anatomi gigi gergaji bagi 2 autoklaf (cth Roboz)
8. Jaring keluli tahan karat yang diautoklaf: Potong jejaring keluli tahan karat 40 jejaring kepada segi empat sama kecil 5cm × 5cm, lipat tepi ke bawah, dan kemudian bengkokkan empat sisi ke dalam mangkuk segi empat tepat cetek; kerajang dibalut dan diautoklaf.
kaedah eksperimen:
1. Cairkan 2 tiub 1 ml 4000 U/ml kolagenase D (cukup untuk 20 limpa): 1 ml 9 ml HBSS (dicairkan kepada 4000 U/ml, langkah 8), 1 ml 39 ml HBSS (dicairkan kepada 100 U/) Ml). Letakkan di atas ais.
2. Pasangkan jarum 22G pada picagari 10 ml yang diisi dengan 100 U/ml kolagenase. 10 ml larutan 100 U/ml telah ditambah ke dalam cawan Petri 100 mm.
3. Ambil bekas petri berdiameter 100mm lagi untuk operasi. Pegang forsep dalam satu tangan, picagari di tangan yang lain, dan ibu jari pada omboh. Limpa tetikus diikat dengan forsep, dan pinggir sempit kapsul limpa ditusuk dengan jarum, dan 100 ml 100 U/ml kolagenase disuntik. Gunakan forsep untuk menolak limpa ke arah jarum dan memajukan jarum beberapa milimeter. Kolagenase disuntik berulang kali dan diteruskan sehingga 1 ml kolagenase disuntik ke dalam limpa, dan jarum menusuk limpa dari hujung yang lain.
4. Gunakan jarum untuk mengoyakkan limpa dan memindahkannya ke dalam cawan Petri yang mengandungi kolagenase (Langkah 2). Ulang sehingga semua limpa disuntik dan koyak.
5. Kumpulkan ampaian sel dari pinggan kedua dan tambahkan ke dalam tiub empar 50 ml yang diletakkan di atas ais. Pinggan itu dibilas dengan 3 ml 100 U/ml kolagenase dan ditambah kepada tiub emparan 50 ml di atas.
6. Tambah 3 ml 100 U/ml kolagenase ke dalam cawan Petri. Limpa yang dicincang dipindahkan ke cawan Petri secara bergilir-gilir. Ia dikoyakkan dengan 2 pinset menjadi kepingan kecil 1 mm di bahagian tepi supaya ia boleh melalui diameter dalam pipet 5 ml. Selepas semua limpa dicincang, larutan kolagenase dalam piring petri yang sebelum ini diletakkan pada kepingan limpa ditambah dan ditiup ganas beberapa kali dengan pipet 5 ml.
7. Condongkan cawan Petri, keluarkan kepingan besar serpihan, dan pindahkan penggantungan sel ke tiub emparan 50 ml yang diletakkan di atas ais dalam langkah 5. Pinggan mangkuk telah dibasuh dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase dan dimasukkan ke dalam tiub emparan.
8. Tambahkan 10 ml 400 U/ml kolagenase pada kepingan limpa yang tertinggal di dalam pinggan. Selepas pipet beberapa kali, masukkan ke dalam inkubator selama 30-90 minit.
9. Pada peringkat akhir pengeraman, hancurkan kepingan dan sedutkannya ke dalam jejaring keluli steril berdiameter 100 mm cawan Petri.
10. Selamatkan satu hujung stensil dengan pinset, basuh kepingan dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase, dan kemudian kisar kepingan dengan pelocok picagari steril 5 ml. Hancurkan sehingga semua bahan merah dikeluarkan dari tisu. Jaring keluli telah dibasuh dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase.
11. Keluarkan stensil dari piring Petri dan buang butiran pelekat yang tidak berwarna. Cecair dalam piring Petri ditiup dengan kuat dan dipindahkan ke tiub emparan 50 ml pada langkah 7. Pinggan itu dibasuh dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase dan ditambah ke dalam tiub emparan (kira-kira 0.5% sel dendritik atau kurang).
12. Jika perlu, sentrifuge dengan BSA berketumpatan tinggi.
lampiran:
Sel darah merah biri-biri terkonjugasi antibodi (EA):
2.5 ml eritrosit biri-biri yang dikumpul (diekstrak dalam larutan Alsever; Cocalico) dibasuh 3 kali dengan PBS, dan disentrifugasi pada 350 g selama 5 minit selepas setiap pencucian. Ia kemudiannya dicairkan kepada 5% penggantungan sel (10 9 sel/ml) dengan PBS segar. Serum anti-eritrosit arnab yang sangat sensitif telah dicairkan 1:50 dalam penggantungan sel 5% (mungkin membentuk dos antibodi subagglutinasi). Inkubasi selama 2 jam pada suhu bilik dan sekali-sekala terbalikkan larutan secara perlahan-lahan. EA yang terbentuk telah dibasuh 3 kali dengan RPMI 1640 (Life Technologies), dan kemudian EA dicairkan kepada 5% penggantungan sel dengan PBS. Simpan pada suhu 4 ° C selama 2 minggu dan basuh sekali dengan RPMI sebelum digunakan.
Medium lengkap RPMI-5:
RPMI1640 medium (Life Technologies), mengandungi:
5% FBS, haba dinyahaktifkan pada 56 ° C selama 1 jam
10mmol/L HEPES
20mg/ml gentamicin sulfat (Teknologi Kehidupan)
50mmol/ml 2-ME
Pensterilan penapisan
Penyelesaian BSA ketumpatan tinggi:
Dalam kelalang volumetrik 1 L, tambahkan 186 ml PBS, 29 ml 1 mol/L NaOH, 65 ml air (berhati-hati, perhatikan cecair dan jangan percik di dalam botol). Jangan kacau, sapukan 106g BSA (pecahan Cohn V, BSA penuh disyorkan) pada permukaan larutan, tutup dengan kerajang timah, dan sejukkan semalaman untuk melarutkan BSA perlahan-lahan.
Keesokan harinya, goncangan lembut telah bertukar menjadi larutan yang jelas berwarna coklat; indeks biasan diukur kepada tempat perpuluhan keempat terdekat. Ketumpatan BSA yang betul (1.080 g/ml) mempunyai indeks biasan 1.384 hingga 1.385 pada 25 °C. Selepas membetulkan indeks biasan, pH diukur dengan kertas ujian. pH hendaklah antara 7.0 dan 7.4 dan secara amnya tiada pelarasan diperlukan.
Larutan penapisan steril. Penapis 47 mm (jenis Millpore) diletakkan di atas unit penapis 500 ml (Nalgene #156-4045) dan penapis telah dibasahi dengan sedikit BSA. Penapis vakum selama beberapa minit sehingga BSA ditapis. Keluarkan pam vakum dan tambahkan baki larutan BSA dengan teliti ke dalam takungan di bahagian atas penapis (elakkan berbuih. Gunakan pam vakum dan penapis untuk menapis baki BSA, ≥ 10 min). Ia boleh disimpan selama 3 bulan pada suhu 4 °C.
Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co., Ltd.
