Arahan Tikus Collagenase II (Collagenase II) Enzyme Linked Immunoassay (ELISA)

Syarikat kami adalah pembekal kit ELISA. Harga berpatutan. Perkhidmatan pra-jualan, dalam jualan dan selepas jualan disediakan untuk anda. Sediakan perkhidmatan ujian percuma, sila hubungi kami!

Kolagenase II (ELISA) Tikus

Manual arahan kit

Reagen ini adalah untuk kegunaan penyelidikan sahaja

Tujuan: Kit ini digunakan untuk menentukan kandungan Kolagenase II dalam serum tikus, plasma dan sampel cecair yang berkaitan.

Prinsip eksperimen:

Kit ini menggunakan kaedah sandwic dwi-antibodi untuk menentukan tahap Kolagenase II dalam spesimen. Plat mikroliang disalut dengan antibodi Collagenase II tikus yang telah dimurnikan untuk membuat antibodi fasa pepejal. Kolagenase II telah ditambah pada mikrowell bersalut antibodi monoklonal secara bergilir-gilir, diikuti oleh antibodi kolagenase II (Collagenase II) berlabel HRP untuk membentuk kompleks antibodi berlabel antibodi-antigen-enzim. Selepas mencuci menyeluruh, substrat TMB ditambah untuk pembangunan warna. TMB ditukar kepada biru di bawah pemangkinan enzim HRP, dan menjadi kuning akhir di bawah tindakan asid. Kedalaman warna berkorelasi positif dengan Collagenase II dalam sampel. Penyerapan (nilai OD) diukur dengan pembaca plat mikro pada panjang gelombang 450 nm, dan kepekatan kolagenase tikus II (Collagenase II) dalam sampel dikira dengan lengkung piawai.

Pemprosesan sampel dan keperluan:

1. Serum: darah suhu bilik membeku secara semula jadi selama 10-20 minit, disentrifugasi selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati dan sentrifuge semula jika mendakan muncul semasa penyimpanan.

2. Air kencing: dikumpul dalam tiub steril dan disentrifugasi selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Jika mendakan terbentuk semasa penyimpanan, sentrifuge semula. Pleural dan asites, pelaksanaan rujukan cecair serebrospinal.

3. Plasma: EDTA atau natrium sitrat hendaklah dipilih sebagai antikoagulan mengikut keperluan spesimen. Selepas mencampurkan selama 10-20 minit, sentrifuge selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Jika mendakan terbentuk semasa penyimpanan, ia hendaklah disentrifugasi semula.

4. Supernatan kultur sel: Apabila mengesan komponen yang dirembes, kumpulkan dengan tiub steril. Empar selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Apabila mengesan komponen di dalam sel, cairkan penggantungan sel dengan PBS (PH7.2-7.4), dan kepekatan sel akan mencapai kira-kira 1 juta / ml. Melalui pembekuan dan pencairan berulang, sel-sel dimusnahkan dan komponen intrasel dibebaskan. Empar selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Jika mendakan terbentuk semasa penyimpanan, ia hendaklah disentrifugasi semula.

5. Susun spesimen: selepas memotong spesimen, timbang. Tambahkan sejumlah PBS, PH7.4. Cepat beku dan simpan dengan nitrogen cecair untuk kegunaan kemudian. Selepas spesimen cair, ia masih mengekalkan suhu 2-8 ° C. Tambah sejumlah PBS (PH7.4) dan homogenkan spesimen dengan manual atau homogenizer. Empar selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Selepas diakutip, sebahagiannya akan diuji, dan selebihnya dibekukan untuk kegunaan masa hadapan.

6. Spesimen hendaklah diekstrak secepat mungkin selepas pengumpulan. Pengekstrakan hendaklah dijalankan mengikut literatur yang berkaitan. Eksperimen hendaklah dijalankan secepat mungkin selepas pengekstrakan. Jika ujian tidak dapat dilakukan dengan segera, spesimen boleh disimpan pada -20 ℃, tetapi pembekuan dan pencairan berulang harus dielakkan.

7. Sampel yang mengandungi NaN3 tidak dapat dikesan kerana NaN3 menghalang aktiviti lobak pedas peroksidase (HRP).

Langkah berjaga-berjaga:

1. Kristal boleh dimendakkan dalam cecair pencuci pekat, yang boleh dipanaskan dan dilarutkan dalam mandi air semasa pencairan, dan hasilnya tidak akan terjejas semasa mencuci.

2. Filem pengedap adalah terhad kepada penggunaan sekali sahaja untuk mengelakkan pencemaran silang.

3. Pensampel hendaklah digunakan pada setiap langkah penambahan sampel, dan ketepatannya hendaklah sentiasa diperiksa untuk mengelakkan ralat ujian. Adalah lebih baik untuk mengawal masa pensampelan dalam masa 5 minit. Jika terdapat banyak spesimen, adalah disyorkan untuk menggunakan pistol tampar untuk menambah sampel.

4. Kit hendaklah diseimbangkan pada suhu bilik selama 15-30 minit sebelum dibawa keluar dari persekitaran yang disejukkan. Jika plat bersalut label enzim tidak dibuka, jalur itu hendaklah disimpan dalam beg bertutup.

5. Sila buat lengkung standard pada masa yang sama setiap pengukuran, sebaiknya buat lubang berganda. Jika kandungan bahan ujian dalam spesimen terlalu tinggi (nilai OD sampel lebih besar daripada nilai OD telaga pertama telaga piawai), sila terlebih dahulu mencairkannya dengan beberapa kali tertentu (n kali) pelarut sampel dan kemudian tentukannya. Semasa mengira, sila darabkan jumlah pencairan Berganda (× n × 5).

6. Sila jauhkan substrat daripada cahaya.

7. Patuhi arahan dengan tegas, dan keputusan ujian mesti ditentukan oleh pembaca plat mikro.

8. Semua sampel, cecair pencuci dan pelbagai bahan buangan hendaklah dianggap sebagai agen berjangkit.

9. Komponen kumpulan berlainan reagen ini tidak boleh dicampur.

10. Jika terdapat sebarang perbezaan dengan manual Bahasa Inggeris, manual Bahasa Inggeris akan diutamakan.

Komposisi kit:

Komposisi kit

Konfigurasi 48 lubang

Konfigurasi 96-telaga

jimat

Arahan

1 hidangan

1 hidangan

Filem pengedap

2 keping (48)

2 keping (96)

beg tertutup

1

1

Plat bersalut enzim

1 × 48

1 × 96

Simpan pada 2-8 ℃

Produk standard: 2700ng / L

0.5ml × 1 botol

0.5ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Pencairan standard

1.5ml × 1 botol

1.5ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Reagen enzim

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Sampel pencair

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Pemaju A cecair

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Cecair pemaju B

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Hentikan penyelesaian

3ml × 1 botol

6ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Cecair pencuci pekat

(20ml × 20 kali) × 1 botol

(20ml × 30 kali) × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Langkah

1. Tambah sampel: sediakan telaga kosong secara berasingan (telaga kawalan kosong tidak menambah sampel dan reagen berlabel enzim, selebihnya langkah adalah sama) dan telaga sampel untuk diuji. Tambah 40μl pelarut sampel ke dalam perigi sampel ujian plat bersalut enzim, dan kemudian tambah 10μl sampel yang akan diuji (pencairan akhir sampel ialah 5 kali). Tambah sampel dan tambah sampel ke bahagian bawah telaga mikroplat, cuba jangan sentuh dinding perigi, goncang perlahan-lahan untuk bercampur.

2. Pencairan dan pemuatan produk standard: tetapkan 10 telaga standard pada plat bersalut enzim, tambah 100 μl produk standard dalam telaga pertama dan kedua, dan kemudian tambah produk standard dalam telaga pertama dan kedua 50μl pelarut, gaul rata; kemudian ambil 100μl dari perigi pertama dan perigi kedua dan tambahkannya pada perigi ketiga dan keempat masing-masing, dan kemudian tambahkan 50μl pencair standard masing-masing ke perigi ketiga dan keempat, gaul rata; Kemudian ambil 50μl setiap satu dalam telaga ketiga dan keempat dan buangnya, kemudian tambahkan 50μl setiap satu kepada telaga kelima dan keenam, dan kemudian tambahkan 50ul larutan pencairan standard masing-masing ke telaga kelima dan keenam, dan gaul rata; Selepas mencampurkan, ambil 50μl dari telaga kelima dan keenam dan masing-masing menambahnya pada telaga ketujuh dan kelapan. Kemudian tambah 50μl larutan pencairan piawai masing-masing ke telaga ketujuh dan kelapan. Ambil 50μl daripada lapan telaga dan tambahkan kepada telaga kesembilan dan kesepuluh. Kemudian tambah 50μl larutan pencairan piawai ke telaga kesembilan dan kesepuluh. Selepas mencampurkan, ambil 50μl dari telaga kesembilan dan kesepuluh dan buang. (Selepas pencairan, isipadu setiap telaga ialah 50μl, dan kepekatan ialah 1800ng / L, 1200ng / L, 600ng / L, 300ng / L, 150ng / L)

3. Pengeraman: Tutup plat dengan plat pengedap dan eramkan pada suhu 37 ° C selama 30 minit.

4. Mencampur larutan: Cairkan 30 kali (20 kali 48T) cecair pencuci pekat dengan air suling 30 kali (20 kali 48T) dan kemudian gunakan.

5. Mencuci: Berhati-hati kupas filem pengedap, buang cecair, putar kering, isi setiap perigi dengan cecair pencuci, biarkan selama 30 saat dan kemudian buang, ulang 5 kali dan keringkan.

6. Pengeraman: Operasi adalah sama seperti 3.

7. Mencuci: Operasi adalah sama seperti 5.

8. Pembangunan warna: Tambah 50μl pembangun A ke setiap telaga, dan kemudian tambah 50μl pemaju B, gaul perlahan-lahan, dan kembangkan pada 37 ° C dalam gelap selama 15 minit.

9. Tambah enzim: tambah 50μl reagen label enzim pada setiap telaga, kecuali telaga kosong.

10. Penamatan: Tambah 50μl larutan henti pada setiap telaga untuk menghentikan tindak balas (pada masa ini warna biru akan bertukar kepada kuning).

11. Penentuan: Ukur penyerapan (nilai OD) setiap telaga mengikut urutan dengan penghawa dingin kosong pada panjang gelombang sifar dan 450 nm. Pengukuran hendaklah dijalankan dalam masa 15 minit selepas menambah larutan henti.

Syarat penyimpanan dan tempoh sah:

1. Simpan kit: 2-8 ℃.

2. Tempoh sah: 6 bulan

Prestasi kit:

1. Pekali korelasi R antara regresi linear sampel dan kepekatan jangkaan adalah melebihi 0.95.

2. Kumpulan dan kelulusan hendaklah masing-masing kurang daripada 9% dan 11%.

julat peperiksaan:

100ng / L -2000ng / L

Pengiraan:

Mengambil kepekatan piawai sebagai absis dan nilai OD sebagai ordinat, lukis lengkung piawai pada kertas koordinat, dan cari kepekatan yang sepadan daripada lengkung piawai mengikut nilai OD sampel; kemudian darabkannya dengan faktor pencairan; Kira persamaan regresi linear lengkung piawai dengan nilai OD, gantikan nilai OD sampel ke dalam persamaan, kira kepekatan sampel, dan darabkannya dengan faktor pencairan untuk mendapatkan kepekatan sebenar sampel.