Bovine Collagenase (Collagenase) ELISA

October 22, 2024

Manual arahan kit

Reagen ini adalah untuk tujuan penyelidikan sahaja: Kit ini digunakan untuk menentukan kandungan kolagenase dalam serum lembu, plasma dan sampel cecair yang berkaitan.

Prinsip eksperimen:

Kit ini menggunakan kaedah sandwic antibodi berganda untuk menentukan tahap kolagenase lembu dalam spesimen. Salutkan plat mikro dengan antibodi kolagenase lembu (Collagenase) yang telah dimurnikan untuk membuat antibodi fasa pepejal, tambah kolagenase (Collagenase) pada perigi mikro bersalut antibodi monoklonal secara bergilir-gilir, dan kemudian gabungkan dengan antibodi Kolagenase berlabel HRP Untuk membentuk antibodi-antigen-enzim-enzim yang dilabel kompleks TMB telah ditambah, dan selepas pembangunan kompleks antibodi TMB yang dilabelkan dengan substrat ditambah, dan selepas pembangunan kompleks antibodi TMB berwarna. TMB ditukar kepada biru di bawah pemangkinan enzim HRP, dan menjadi kuning akhir di bawah tindakan asid. Kedalaman warna berkorelasi positif dengan kolagenase dalam sampel. Penyerapan (nilai OD) diukur dengan pembaca plat mikro pada panjang gelombang 450 nm, dan kepekatan kolagenase lembu (Collagenase) dalam sampel dikira dengan lengkung piawai.

Komposisi kit:

Komposisi kit

Konfigurasi 48 lubang

Konfigurasi 96-telaga

jimat

Arahan

1 hidangan

Filem pengedap

2 keping (48)

2 keping (96)

beg tertutup

Plat bersalut enzim

1 × 48

1 × 96

Simpan pada 2-8 ℃

Produk standard: 360ng / ml

0.5ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Pencairan standard

1.5ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Reagen enzim

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Sampel pencair

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Pemaju A cecair

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Cecair pemaju B

3 ml × 1 botol

6 ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Hentikan penyelesaian

3ml × 1 botol

6ml × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Cecair pencuci pekat

(20ml × 20 kali) × 1 botol

(20ml × 30 kali) × 1 botol

Simpan pada 2-8 ℃

Pemprosesan sampel dan keperluan:

1. Serum: darah suhu bilik membeku secara semula jadi selama 10-20 minit, disentrifugasi selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati dan sentrifuge semula jika mendakan muncul semasa penyimpanan.

2. Plasma: EDTA atau natrium sitrat harus dipilih sebagai antikoagulan mengikut keperluan spesimen, dicampur selama 10-20 minit, dan disentrifugasi selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Jika mendakan terbentuk semasa penyimpanan, ia hendaklah disentrifugasi semula.

3. Air kencing: dikumpul dalam tiub steril dan disentrifugasi selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Jika mendakan terbentuk semasa penyimpanan, sentrifuge semula. Pleural dan asites, pelaksanaan rujukan cecair serebrospinal.

4. Supernatan kultur sel: Apabila mengesan komponen yang dirembes, kumpulkan dengan tiub steril. Empar selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Apabila mengesan komponen di dalam sel, cairkan penggantungan sel dengan PBS (PH7.2-7.4), dan kepekatan sel akan mencapai kira-kira 1 juta / ml. Melalui pembekuan dan pencairan berulang, sel-sel dimusnahkan dan komponen intrasel dibebaskan. Empar selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Jika mendakan terbentuk semasa penyimpanan, ia hendaklah disentrifugasi semula.

5. Susun spesimen: selepas memotong spesimen, timbang. Tambahkan sejumlah PBS, PH7.4. Cepat beku dan simpan dengan nitrogen cecair untuk kegunaan kemudian. Selepas spesimen cair, ia masih mengekalkan suhu 2-8 ° C. Tambah sejumlah PBS (PH7.4) dan homogenkan spesimen dengan manual atau homogenizer. Empar selama kira-kira 20 minit (2000-3000 rpm). Kumpulkan supernatan dengan berhati-hati. Selepas diakutip, sebahagiannya akan diuji, dan selebihnya dibekukan untuk kegunaan masa hadapan.

6. Spesimen hendaklah diekstrak secepat mungkin selepas pengumpulan. Pengekstrakan hendaklah dijalankan mengikut literatur yang berkaitan. Jika ujian tidak dapat dilakukan dengan segera, spesimen boleh disimpan pada -20 ℃, tetapi pembekuan dan pencairan berulang harus dielakkan.

7. Sampel yang mengandungi NaN3 tidak dapat dikesan kerana NaN3 menghalang aktiviti lobak pedas peroksidase (HRP).

Langkah-langkah:

1. Pencairan dan pemuatan produk standard: tetapkan 10 telaga standard pada plat bersalut enzim, tambah 100 μl produk standard dalam telaga pertama dan kedua, dan kemudian tambah produk standard dalam telaga pertama dan kedua 50μl pelarut, gaul rata; kemudian ambil 100μl dari perigi pertama dan perigi kedua dan tambahkannya pada perigi ketiga dan keempat masing-masing, dan kemudian tambahkan 50μl pencair standard masing-masing ke perigi ketiga dan keempat, gaul rata; Kemudian ambil 50μl setiap satu dalam telaga ketiga dan keempat dan buangnya, kemudian tambahkan 50μl setiap satu kepada telaga kelima dan keenam, dan kemudian tambahkan 50ul larutan pencairan standard masing-masing ke telaga kelima dan keenam, dan gaul rata; Selepas mencampurkan, ambil 50μl dari telaga kelima dan keenam dan masing-masing menambahnya pada telaga ketujuh dan kelapan. Kemudian tambah 50μl larutan pencairan piawai masing-masing ke telaga ketujuh dan kelapan. Ambil 50μl daripada lapan telaga dan tambahkan kepada telaga kesembilan dan kesepuluh. Kemudian tambah 50μl larutan pencairan piawai ke telaga kesembilan dan kesepuluh. Selepas mencampurkan, ambil 50μl dari telaga kesembilan dan kesepuluh dan buang. (Selepas pencairan, isipadu setiap telaga ialah 50μl, dan kepekatannya ialah 240ng / ml, 160ng / ml, 80ng / ml, 40ng / ml, 20ng / ml).

2. Tambah sampel: sediakan telaga kosong (telaga kawalan kosong tidak menambah sampel dan reagen enzim, selebihnya langkah adalah sama) dan telaga sampel untuk diuji. Tambah 40μl pelarut sampel ke dalam perigi sampel ujian plat bersalut enzim, dan kemudian tambah 10μl sampel ujian (pencairan akhir sampel ialah 5 kali). Tambah sampel dan tambah sampel ke bahagian bawah telaga mikroplat, cuba jangan sentuh dinding perigi, goncang perlahan-lahan untuk bercampur.

3. Pengeraman: Tutup plat dengan plat pengedap dan eramkan pada suhu 37 ° C selama 30 minit.

4. Mencampur larutan: Cairkan 30 kali (20 kali 48T) cecair pencuci pekat dengan air suling 30 kali (20 kali 48T) dan kemudian gunakan.

5. Mencuci: Berhati-hati kupas filem pengedap, buang cecair, putar kering, isi setiap perigi dengan cecair pencuci, biarkan selama 30 saat dan kemudian buang, ulang 5 kali dan keringkan.

6. Tambah enzim: tambah 50μl reagen label enzim pada setiap telaga, kecuali telaga kosong.

7. Pengeraman: Operasi adalah sama seperti 3.

8. Mencuci: Operasi adalah sama seperti 5.

9. Pembangunan warna: tambah 50μl pembangun A ke setiap telaga, kemudian tambah 50μl pemaju B, gaul perlahan-lahan, dan kembangkan pada 37 ° C dalam gelap selama 15 minit.

10. Penamatan: Tambah 50μl larutan henti pada setiap telaga untuk menghentikan tindak balas (pada masa ini warna biru akan bertukar kepada kuning).

11. Penentuan: Ukur penyerapan (nilai OD) setiap telaga mengikut urutan dengan penghawa dingin kosong pada panjang gelombang sifar dan 450 nm. Pengukuran hendaklah dijalankan dalam masa 15 minit selepas menambah larutan henti.

Langkah berjaga-berjaga:

1. Kit hendaklah diseimbangkan pada suhu bilik selama 15-30 minit sebelum dibawa keluar dari persekitaran yang disejukkan. Jika plat bersalut label enzim tidak dibuka, jalur itu hendaklah disimpan dalam beg bertutup.

2. Kristal mungkin dimendakkan dalam cecair pencuci pekat, yang boleh dipanaskan dan dilarutkan dalam mandi air semasa pencairan, dan hasilnya tidak akan terjejas semasa mencuci.

3. Pensampel hendaklah digunakan pada setiap langkah penambahan sampel, dan ketepatannya hendaklah sentiasa diperiksa untuk mengelakkan ralat ujian. Adalah lebih baik untuk mengawal masa pensampelan dalam masa 5 minit. Jika terdapat banyak spesimen, adalah disyorkan untuk menggunakan pistol tampar untuk menambah sampel.

4. Sila buat lengkung standard pada masa yang sama setiap pengukuran, sebaiknya buat lubang berganda. Jika kandungan bahan ujian dalam spesimen terlalu tinggi (nilai OD sampel lebih besar daripada nilai OD telaga pertama telaga piawai), sila terlebih dahulu mencairkannya dengan beberapa kali tertentu (n kali) pelarut sampel dan kemudian tentukannya. Semasa mengira, sila darabkan jumlah pencairan Berganda (× n × 5).

5. Filem pengedap adalah terhad kepada penggunaan sekali sahaja untuk mengelakkan pencemaran silang.

6. Sila jauhkan substrat daripada cahaya.

7. Patuhi arahan dengan tegas, dan keputusan ujian mesti ditentukan oleh pembaca plat mikro.

8. Semua sampel, cecair pencuci dan pelbagai bahan buangan hendaklah dianggap sebagai agen berjangkit.

9. Komponen kumpulan berlainan reagen ini tidak boleh dicampur.

10. Jika terdapat sebarang perbezaan dengan manual Bahasa Inggeris, manual Bahasa Inggeris akan diutamakan.

Pengiraan:

Mengambil kepekatan piawai sebagai absis dan nilai OD sebagai ordinat,

Lukiskan lengkung piawai pada kertas koordinat, mengikut OD sampel

Nilai ditentukan oleh lengkung piawai; kemudian didarab dengan pencairan

Berbilang; atau mengira piawai menggunakan kepekatan dan nilai OD piawai

Persamaan regresi linear bagi lengkung kuasi, nilai OD sampel